{"id":2485,"date":"2021-04-27T13:10:52","date_gmt":"2021-04-27T16:10:52","guid":{"rendered":"https:\/\/www.blogs.unicamp.br\/covid-19\/?p=2485"},"modified":"2021-04-27T13:10:52","modified_gmt":"2021-04-27T16:10:52","slug":"pcr-e-a-sopa-de-letrinhas-cientifica","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/clorofreela.com.br\/revistablogs\/2021\/04\/27\/pcr-e-a-sopa-de-letrinhas-cientifica\/","title":{"rendered":"PCR e a sopa de letrinhas cient\u00edfica"},"content":{"rendered":"\n

Por: Rafael Sanchez Luperini e Renato Augusto Corr\u00eaa dos Santos<\/em><\/p>\n\n\n\n

PCR, qPCR, RT-qPCR: o que significam essas siglas e o que elas t\u00eam a ver com os fungos? As discuss\u00f5es sobre t\u00e9cnicas e metodologias cient\u00edficas utilizadas para diagn\u00f3stico da COVID-19 se popularizaram nos mais diversos meios de comunica\u00e7\u00e3o. <\/p>\n\n\n\n

O RT-qPCR (Reverse Transcriptase Quantitative Polymerase Chain Reaction, em ingl\u00eas), por exemplo, \u00e9 o m\u00e9todo mais eficaz para diagnosticar um paciente e ficou conhecido como \u201co teste do cotonete no nariz\u201d. E n\u00f3s queremos saber:<\/p>\n\n\n\n

  1. Voc\u00ea j\u00e1 se perguntou como ele funciona? <\/li>
  2. Como e quando surgiu essa metodologia cient\u00edfica t\u00e3o avan\u00e7ada? <\/li>
  3. Voc\u00ea sabia que existem ainda outras variantes desta t\u00e9cnica, chamadas de PCR, qPCR e RT-PCR? <\/li>
  4. Al\u00e9m das letras em cada sigla, quais as verdadeiras diferen\u00e7as por tr\u00e1s de cada uma dessas t\u00e9cnicas? <\/li><\/ol>\n\n\n\n

    Esse texto busca trazer as respostas para quem est\u00e1 cheio de d\u00favidas a respeito dessas interessantes, e extremamente vers\u00e1teis, ferramentas das ci\u00eancias biol\u00f3gicas.<\/p>\n\n\n\n

    A hist\u00f3ria do PCR<\/h2>\n\n\n\n

    Essas metodologias s\u00e3o geralmente aplicadas na identifica\u00e7\u00e3o de seres vivos a n\u00edveis bastante espec\u00edficos, e para esclarecer melhor todas essas perguntas, vamos explicar a t\u00e9cnica, juntamente com a sua hist\u00f3ria. <\/p>\n\n\n\n

    Em 1983 aconteceu uma das mais significantes descobertas do s\u00e9culo XX. O cientista Dr. Kary Mullis desenvolveu a rea\u00e7\u00e3o em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction ou PCR). A partir dessa t\u00e9cnica se tornou poss\u00edvel obter muitas c\u00f3pias de um mesmo fragmento de material gen\u00e9tico, possibilitando a obten\u00e7\u00e3o de grandes quantidades de DNA de uma amostra gen\u00e9tica de um organismo.<\/p>\n\n\n\n

    A t\u00e9cnica possibilita a produ\u00e7\u00e3o de fragmentos de DNA de interesse partindo de pequenas quantidades de amostras de DNA usando a enzima DNA polimerase, a mesma que participa da multiplica\u00e7\u00e3o do material gen\u00e9tico nas c\u00e9lulas. Esta enzima se liga a um pequeno fragmento (o iniciador, ou primer, em ingl\u00eas), desenhado especialmente para se ligar ao DNA alvo, produzindo uma sequ\u00eancia complementar ao fragmento de DNA de interesse, escolhido antes do in\u00edcio da an\u00e1lise.<\/p>\n\n\n\n

    O primeiro estudo detalhando a metodologia da t\u00e9cnica foi publicado no peri\u00f3dico cient\u00edfico Science, no ano de 1985, revolucionando a ci\u00eancia e as possibilidades de descobertas ao se trabalhar com DNA. Por\u00e9m essa metodologia ainda apresentava uma s\u00e9rie de desafios, visto que \u00e9 composta de 3 etapas demonstradas na imagem abaixo:<\/p>\n\n\n\n

    <\/p>\n\n\n\n

    Rea\u00e7\u00e3o em cadeia da polimerase explicada passo a passo<\/p>\n\n\n\n

    A realiza\u00e7\u00e3o de 20 a 40 ciclos promove a amplifica\u00e7\u00e3o da regi\u00e3o que se pretende analisar, seja ela um gene humano espec\u00edfico, ou de microrganismos ou basicamente qualquer material gen\u00e9tico que se deseja multiplicar para analisar posteriormente.<\/p>\n\n\n\n

    Varia\u00e7\u00f5es da t\u00e9cnica de PCR<\/h2>\n\n\n\n

    Ao longo dos anos, come\u00e7aram a surgir varia\u00e7\u00f5es da t\u00e9cnica, e aplica\u00e7\u00f5es das mais diversas formas, e \u00e9 nesse contexto que surge a an\u00e1lise t\u00e3o utilizada hoje em dia nos diagn\u00f3sticos de COVID-19, a RT-qPCR. <\/p>\n\n\n\n

    E o que significam todas essas letras adicionadas antes da PCR?<\/p>\n\n\n\n

    Elas dizem respeito a uma metodologia com uso de uma enzima chamada Transcriptase Reversa (Reverse Transcriptase, ou RT), que tem a fun\u00e7\u00e3o de produzir uma fita de DNA (chamada de DNA complementar ou cDNA) a partir de uma fita de RNA. <\/p>\n\n\n\n

    Al\u00e9m disso, a letra \u201cq\u201d indica que esta t\u00e9cnica \u00e9 quantitativa e pode ser usada em RT-qPCR e qPCR. Esta metodologia se parece muito com a PCR original, por\u00e9m com a diferen\u00e7a de que s\u00e3o adicionadas sondas fluorescentes de DNA junto das amostras, as quais emitem fluoresc\u00eancia a cada ciclo realizado pelo aparelho.<\/p>\n\n\n\n

    Portanto, durante a amplifica\u00e7\u00e3o, a quantifica\u00e7\u00e3o de DNA \u00e9 determinada pela quantidade de fluoresc\u00eancia emitida pelo produto amplificado a cada ciclo. <\/p>\n\n\n\n

    Isso \u00e9 poss\u00edvel somente com a utiliza\u00e7\u00e3o de um sistema de equipamentos com monitoramento da fluoresc\u00eancia emitida, possibilitando uma quantifica\u00e7\u00e3o mais exata de quanto material gen\u00e9tico existia na amostra inicial, abrindo ainda mais op\u00e7\u00f5es e oportunidades de an\u00e1lises a serem feitas, como ser\u00e1 explicado a seguir.<\/p>\n\n\n\n

    Pesquisas que utilizam a t\u00e9cnica PCR<\/h2>\n\n\n\n

    Agora vamos dar alguns exemplos de pesquisas importantes no Brasil e ao redor do mundo, que utilizam a t\u00e9cnica de PCR e suas variantes.<\/p>\n\n\n\n

    Aplica\u00e7\u00f5es de PCR nas pesquisas agr\u00edcolas do Brasil.<\/h3>\n\n\n\n

    Al\u00e9m dos interesses das aplica\u00e7\u00f5es da t\u00e9cnica na \u00e1rea da sa\u00fade, a agricultura e a ind\u00fastria de alimentos e bebidas tamb\u00e9m se beneficiam da t\u00e9cnica. Em algumas situa\u00e7\u00f5es, a qPCR \u00e9 utilizada em laborat\u00f3rios de an\u00e1lise de alimentos visto que \u00e9 uma t\u00e9cnica altamente espec\u00edfica e sens\u00edvel. Por\u00e9m, dentre as dificuldades est\u00e3o seu alto custo devido \u00e0 necessidade de m\u00e3o de obra especializada, insumos e metodologia para a detec\u00e7\u00e3o e identifica\u00e7\u00e3o de determinados microrganismos.<\/p>\n\n\n\n

    Diversas pesquisas desenvolvidas no Brasil visam o melhoramento da detec\u00e7\u00e3o de fungos que contaminam alimentos, como \u00e9 o caso de esp\u00e9cies das esp\u00e9cies Aspergillus niger e Aspergillus welwitschiae, produtoras de micotoxinas, algumas delas nefrot\u00f3xicas e potencialmente carcinog\u00eanicas. <\/p>\n\n\n\n

    Pesquisas na Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) em 2018, coordenadas pela Dra. Marta Hiromi Taniwaki e em colabora\u00e7\u00e3o com pesquisadores da Universidade Estadual de Londrina (UEL) estudaram o uso da t\u00e9cnica de qPCR na detec\u00e7\u00e3o destas esp\u00e9cies citadas acima, obtidas de caf\u00e9. O m\u00e9todo desenvolvido possibilita r\u00e1pida, precisa e sens\u00edvel detec\u00e7\u00e3o das esp\u00e9cies citadas, que s\u00e3o morfologicamente id\u00eanticas.<\/p>\n\n\n\n

    PCR em laborat\u00f3rios de fitopatologia<\/h3>\n\n\n\n

    No Brasil, h\u00e1 algumas cl\u00ednicas fitopatol\u00f3gicas que fazem a an\u00e1lise de qPCR para a detec\u00e7\u00e3o de doen\u00e7as importantes em plantas, como \u00e9 o caso da EMBRAPA, a ESALQ (Universidade de S\u00e3o Paulo, em Piracicaba), o Centro de Cana e o Centro de Citricultura, ambos pertencentes ao Instituto Agron\u00f4mico de Campinas (IAC). <\/p>\n\n\n\n

    A pesquisadora La\u00eds Moreira Granato, do Instituto Agron\u00f4mico de Campinas (IAC), contou um pouco sobre a aplica\u00e7\u00e3o de qPCR no cotidiano. Na pr\u00e1tica, laborat\u00f3rios de fitopatologia usam a t\u00e9cnica de RT-qPCR para a detec\u00e7\u00e3o de v\u00edrus de RNA  e at\u00e9cnica de qPCR para detec\u00e7\u00e3o de fungos e bact\u00e9rias em citros. Geralmente o citricultor leva amostras de frutas ou folhas para a cl\u00ednica do Centro de Citricultura procurando por essas doen\u00e7as.<\/p>\n\n\n\n

    Infelizmente, como ja foi dito, os insumos e equipamentos que envolvem a qPCR s\u00e3o caros! No entanto, os citricultores precisam desse servi\u00e7o para ter certeza de que n\u00e3o h\u00e1 doen\u00e7as escondidas em seus pomares. <\/p>\n\n\n\n

    Uma das motiva\u00e7\u00f5es para se pagar um pouco mais por esse servi\u00e7o envolve a legisla\u00e7\u00e3o que regula a exporta\u00e7\u00e3o dos vegetais. Frutas de mesa, quando exportadas para a Europa, precisam obrigatoriamente passar por uma comprova\u00e7\u00e3o de que n\u00e3o h\u00e1 presen\u00e7a de alguns fungos. Um exemplo \u00e9 Phyllosticta citricarpa nas cascas das laranjas. Este fungo n\u00e3o existe na Europa e a legisla\u00e7\u00e3o n\u00e3o permite que nada entre sem uma comprova\u00e7\u00e3o de que est\u00e1 \u201climpo\u201d.<\/p>\n\n\n\n

    Na pr\u00e1tica, em algumas situa\u00e7\u00f5es, mesmo que a detec\u00e7\u00e3o pudesse ser feita, quest\u00f5es ligadas ao sistema produtivo podem ser um problema, como a limita\u00e7\u00e3o de equipamentos, disponibilidade de equipes de inspe\u00e7\u00e3o e de corpo t\u00e9cnico. Mas, al\u00e9m disso, descobrimos algo curioso quando o assunto \u00e9 priorizar um problema ou outro na agricultura, e que podem deixar os fungos \u201cde lado\u201d, como nos contou a pesquisadora Dra. Andressa Bini, do Centro de Cana do IAC. <\/p>\n\n\n\n

    O exemplo \u00e9 o fungo Colletotrichum falcatum, causador da podrid\u00e3o vermelha em cana-de-a\u00e7\u00facar. Acreditava-se que o fungo infectaria apenas plantas a partir de ferimentos causados por uma praga, a lagarta de Diatraea saccharalis. Seguindo este racioc\u00ednio, a prioridade no passado era controlar apenas a praga, mas n\u00e3o o fungo em si, que seria uma consequ\u00eancia oportunista. <\/p>\n\n\n\n

    No entanto, a realidade \u00e9 que os fungos conseguem infectar as plantas mesmo na aus\u00eancia da praga chamada de \u201cbroca\u201d, tornando a detec\u00e7\u00e3o do fungo uma prioridade, j\u00e1 que sem um controle efetivo da doen\u00e7a, podem ocorrer perdas de at\u00e9 35% da produ\u00e7\u00e3o e hoje o pat\u00f3geno j\u00e1 ocorre pelo menos no Tri\u00e2ngulo Mineiro, no Mato Grosso do Sul e em algumas regi\u00f5es de S\u00e3o Paulo.<\/p>\n\n\n\n

    Os eucaliptos e o fungo Austropuccinia psidii<\/h3>\n\n\n\n

    Outro exemplo de pesquisa aplicada e com uso de qPCR tamb\u00e9m vem da ESALQ! O eucalipto \u00e9 uma planta muito importante para a produ\u00e7\u00e3o de madeira e papel em nosso pa\u00eds. Uma doen\u00e7a f\u00fangica causada por Austropuccinia psidii, a ferrugem, \u00e9 conhecida como problem\u00e1tica para esta cultura. <\/p>\n\n\n\n

    Um grande problema da detec\u00e7\u00e3o desta doen\u00e7a \u00e9 que o fungo \u00e9 normalmente percebido apenas ap\u00f3s o aparecimento de sintomas nas pl\u00e2ntulas, quando o problema j\u00e1 \u00e9 muito grande. Os m\u00e9todos usados geralmente s\u00e3o pouco eficientes ou pouco sens\u00edveis. Apostando na qPCR, mais sens\u00edvel, mais r\u00e1pida e menos laboriosa, pesquisadores da Universidade de S\u00e3o Paulo (USP), em 2018, propuseram o uso de qPCR para a detec\u00e7\u00e3o prematura da doen\u00e7a em eucalipto. Outra aplica\u00e7\u00e3o interessante desta an\u00e1lise, sugerida pelos pesquisadores, \u00e9 a identifica\u00e7\u00e3o r\u00e1pida de pl\u00e2ntulas suscet\u00edveis ou resistentes \u00e0 doen\u00e7a em programas de melhoramento.<\/p>\n\n\n\n

    Como pudemos ver, geralmente as limita\u00e7\u00f5es ainda est\u00e3o no alto custo dessa tecnologia recente, por\u00e9m as aplica\u00e7\u00f5es s\u00e3o as mais diversas, e ainda h\u00e1 muito para se desenvolver na \u00e1rea. Ainda estamos no come\u00e7o de uma nova era, e a tend\u00eancia \u00e9 que a t\u00e9cnica seja aprimorada e torne-se mais barata e aplic\u00e1vel com o passar dos anos.<\/p>\n\n\n\n

    Fontes consultadas<\/h4>\n\n\n\n