{"id":942,"date":"2020-04-26T01:04:56","date_gmt":"2020-04-26T04:04:56","guid":{"rendered":"https:\/\/www.blogs.unicamp.br\/covid-19\/?p=942"},"modified":"2020-04-26T01:04:56","modified_gmt":"2020-04-26T04:04:56","slug":"diagnostico-por-rt-qpcr-o-que-e-isso","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/clorofreela.com.br\/revistablogs\/2020\/04\/26\/diagnostico-por-rt-qpcr-o-que-e-isso\/","title":{"rendered":"Diagn\u00f3stico por RT-qPCR, o que \u00e9 isso?"},"content":{"rendered":"\t\t
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Em tempos como os atuais, temos visto muitos termos t\u00e9cnicos espec\u00edficos na m\u00eddia e em notas de institui\u00e7\u00f5es que falam tanto da doen\u00e7a COVID-19, quanto do SARs-Cov-2 (o novo Coronav\u00edrus), quanto de sintomas e testes de diagn\u00f3sticos.<\/span><\/p>\n

Em meio a todas estas informa\u00e7\u00f5es, embora nos habituemos a ver os termos, n\u00e3o necessariamente compreendemos do que se trata. Em especial sobre os diagn\u00f3sticos da doen\u00e7a, temos visto que h\u00e1 mais de um tipo de teste poss\u00edvel de ser feito.<\/span><\/p>\n

A <\/span>For\u00e7a Tarefa da UNICAMP<\/span><\/a> anunciou que far\u00e1 o <\/span>teste chamado RT-qPCR<\/span><\/a>, o qual foi considerado o principal teste de COVID-19 pela Organiza\u00e7\u00e3o Mundial da Sa\u00fade. Este texto busca explicar um pouco melhor sobre este teste e, tamb\u00e9m, o motivo pelo qual ele \u00e9 importante no diagn\u00f3stico da doen\u00e7a.<\/span><\/p>\n

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Arte: HUB Campinas<\/figcaption><\/figure>\n

Por que a Organiza\u00e7\u00e3o Mundial de Sa\u00fade indica o RT-qPCR como o principal diagn\u00f3stico?<\/b><\/p>\n

O diagn\u00f3stico feito pela t\u00e9cnica RT-qPCR foi preconizado para se realizar o diagn\u00f3stico do COVID-19 em pacientes suspeitos por ser capaz de verificar a presen\u00e7a de at\u00e9 mesmo uma \u00fanica c\u00f3pia do material gen\u00e9tico do v\u00edrus (como veremos em seguida) e, tamb\u00e9m ser uma t\u00e9cnica amplamente estabelecida dentro de laborat\u00f3rios de biologia molecular ao redor do mundo. Isto \u00e9, por ser uma t\u00e9cnica que grande parte dos laborat\u00f3rios do mundo inteiro j\u00e1 conhece o protocolo e que \u00e9 usado de maneira usual em suas pesquisas.<\/span><\/p>\n

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E o que significam estas siglas? O que \u00e9, afinal, uma PCR e uma RT-PCR?\u00a0<\/b><\/p>\n

Desde quando foi criada at\u00e9 os dias atuais, as t\u00e9cnicas de PCR t\u00eam sido usadas em uma grande gama de pesquisas cient\u00edficas, desde estudos sobre express\u00e3o g\u00eanica a detec\u00e7\u00e3o de varia\u00e7\u00f5es gen\u00e9ticas dentro de uma popula\u00e7\u00e3o. Vamos compreender um pouco mais das etapas desta t\u00e9cnica e porque ela \u00e9 importante para a detec\u00e7\u00e3o do novo Coronav\u00edrus?<\/span><\/p>\n

A PCR \u00e9 a sigla que significa, em portugu\u00eas, <\/span>Rea\u00e7\u00e3o em Cadeia de Polimerase. <\/b>\u00c9 uma t\u00e9cnica de biologia molecular muito usada para analisar a presen\u00e7a ou aus\u00eancia de um gene no DNA de um ser vivo. <\/span>Polimerase <\/b>\u00e9 a enzima respons\u00e1vel, dentro das c\u00e9lulas, por catalisar a adi\u00e7\u00e3o de novos nucleot\u00eddeos a uma cadeia de DNA ou RNA. Isto \u00e9, ela proporciona agilidade e efic\u00e1cia na duplica\u00e7\u00e3o ou transcri\u00e7\u00e3o de mol\u00e9culas de DNA ou RNA.<\/span><\/p>\n

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Arte: HUB Campinas<\/figcaption><\/figure>\n

Ao usarmos a enzima polimerase em uma rea\u00e7\u00e3o em cadeia, dentro de um ambiente controlado (tal como na t\u00e9cnica que estamos explicando), conseguimos “amplificar” o material gen\u00e9tico de uma amostra coletada. Isto \u00e9, conseguimos multiplicar o n\u00famero de material a partir de uma pequena quantidade de DNA ou RNA, e assim analisar a presen\u00e7a de trechos espec\u00edficos – como a de v\u00edrus, por exemplo.\u00a0<\/span><\/p>\n

A t\u00e9cnica PCR acontece com a adi\u00e7\u00e3o de v\u00e1rias mol\u00e9culas diferentes, para desempenhar pap\u00e9is definidos na identifica\u00e7\u00e3o do material gen\u00e9tico que queremos multiplicar. Para realizar a PCR, n\u00f3s misturamos: uma enzima capaz de duplicar o DNA, resistente a altas temperaturas; bases nitrogenadas (os \u201ctijolos\u201d que formam o DNA); <\/span>primers<\/span><\/i> (pequenos moldes de RNA que grudam no come\u00e7o do gene ou segmento g\u00eanico de interesse) e, por fim, o DNA do organismo que se quer analisar. Ao submetermos todos estes elementos a ciclos de altas e baixas temperaturas, somos capazes de multiplicar de forma exponencial a quantidade de c\u00f3pias daquele peda\u00e7o de DNA que temos interesse.<\/span><\/p>\n

No caso de um teste diagn\u00f3stico, ao se aplicar esta t\u00e9cnica, saberemos se <\/span>existe<\/i><\/b> o DNA do organismo (v\u00edrus) que estamos tentando detectar, ap\u00f3s executar outra t\u00e9cnica chamada eletroforese em gel de agarose\/poliacrilamida, que permite a visualiza\u00e7\u00e3o dos trechos de material gen\u00e9tico que foram multiplicados. Isto \u00e9, se a pessoa est\u00e1 infectada, o DNA em quest\u00e3o ser\u00e1 amplificado e o diagn\u00f3stico ser\u00e1 <\/span>positivo<\/i><\/b> (mas ainda n\u00e3o \u00e9 deste protocolo que se trata o diagn\u00f3stico do Coronav\u00edrus! <\/span>Calma que chegaremos l\u00e1!<\/b>).<\/span><\/p>\n

O DNA e o RNA possuem pequenas diferen\u00e7as, quimicamente. O SARs-CoV-2, que \u00e9 o material que queremos analisar em nossas amostras, \u00e9 um v\u00edrus cujo material gen\u00e9tico \u00e9 uma mol\u00e9cula de RNA. E isto faz diferen\u00e7a no protocolo que temos que estabelecer\u2026 Para isso, usamos a t\u00e9cnica RT-PCR, que \u00e9 a <\/span>Rea\u00e7\u00e3o em Cadeia de Polimerase de Transcri\u00e7\u00e3o Reversa<\/b>.<\/span><\/p>\n

A grande diferen\u00e7a da PCR para a RT-PCR \u00e9 que antes de fazermos todo o processo dito acima, n\u00f3s pegamos o RNA do v\u00edrus e convertemos em um DNA complementar a ele mesmo, o chamado cDNA, (um processo que ficou famoso quando o HIV come\u00e7ou a ser estudado) e adicionamos esse cDNA a rea\u00e7\u00e3o, no lugar do DNA gen\u00f4mico do organismo.<\/span><\/p>\n

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E, por fim, qual a diferen\u00e7a para o RT-PCR quantitativo (RT-qPCR)?<\/b><\/p>\n

Geralmente as RT-PCR est\u00e3o associadas a PCR quantitativa. Este processo nos permite saber quanto um gene ou o material gen\u00e9tico de um v\u00edrus ou pat\u00f3geno dentro da c\u00e9lula est\u00e1 sendo produzido.<\/span><\/p>\n

Nesse modelo, um fluor\u00f3foro (uma mol\u00e9cula capaz de emitir luz) \u00e9 preso a uma sonda que se liga ao gene ou peda\u00e7o de DNA de interesse. Enquanto essa mol\u00e9cula fluorescente estiver ligada a essa sonda, a sua luz n\u00e3o \u00e9 emitida, mas uma vez que ela \u00e9 solta, a mol\u00e9cula come\u00e7a a emitir fluoresc\u00eancia.<\/span><\/p>\n

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Arte: HUB Campinas<\/figcaption><\/figure>\n

Quando a enzima respons\u00e1vel por duplicar o DNA chega a esse segmento onde a sonda est\u00e1 ligado, ela corta-a, liberando o fluor\u00f3foro, que dessa forma come\u00e7a a emitir luz(2). A partir de um sensor na m\u00e1quina onde est\u00e1 acontecendo essa rea\u00e7\u00e3o, somos capazes de captar a luz emitida pelo fluor\u00f3foro a cada ciclo de duplica\u00e7\u00e3o do DNA, e por fim, quantificar sua express\u00e3o.<\/span><\/p>\n

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Arte: HUB Campinas<\/figcaption><\/figure>\n

No come\u00e7o da rea\u00e7\u00e3o, h\u00e1 poucas c\u00f3pias do DNA de interesse, e dessa forma a fluoresc\u00eancia emitida \u00e9 pouca, mas com o passar dos ciclos, onde 2 c\u00f3pias se tornam 4, 8, 16, e assim por diante de forma exponencial, a quantidade de luz emitida cresce tamb\u00e9m de forma exponencial e somos capaz de contar a quantidade inicial de mol\u00e9culas que t\u00ednhamos no come\u00e7o.\u00a0<\/span><\/p>\n

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Quais as etapas para realizar o diagn\u00f3stico da COVID-19?<\/b><\/p>\n

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Arte: HUB Campinas<\/figcaption><\/figure>\n

A For\u00e7a Tarefa da Unicamp realizar\u00e1 testes diagn\u00f3sticos que incluem 5 etapas:<\/span><\/p>\n

    \n
  1. Coleta do material dos pacientes (c\u00e9lulas da mucosa da boca e do nariz),\u00a0<\/span><\/li>\n
  2. Extra\u00e7\u00e3o do RNA viral da amostra do paciente<\/span><\/li>\n
  3. Convers\u00e3o em DNA complementar (cDNA) ao RNA<\/span><\/li>\n
  4. Duplica\u00e7\u00e3o exponencial do cDNA por RT-qPCR<\/span><\/li>\n
  5. An\u00e1lise do resultado por especialista para o diagn\u00f3stico<\/span><\/li>\n<\/ol>\n

    Todo este processo demora algumas horas, normalmente. No entanto, estamos vivendo um per\u00edodo atribulado, com muitos testes sendo solicitados simultaneamente. Por enquanto, a FT-Unicamp t\u00eam a previs\u00e3o de disponibilizar o resultado dos testes entre 24 e 48 horas. Mas este tempo pode aumentar dependendo da demanda que tivermos durante toda a pandemia.<\/span><\/p>\n

    Dire\u00e7\u00e3o de arte desta postagem:
    <\/strong>Anat\u00e1lia Oliveira Santos – Diretora de arte do HUB Campinas<\/p>\n

    Texto feito para a For\u00e7a Tarefa da Unicamp<\/strong><\/p>\n

    \"\"<\/p>\n

    Nossos sites institucionais:<\/b><\/p>\n

    For\u00e7a Tarefa da Unicamp<\/span><\/a><\/p>\n

    Unicamp – Coronav\u00edrus<\/span><\/a><\/p>\n

    Para saber mais:<\/b><\/p>\n

    Organiza\u00e7\u00e3o Mundial de Sa\u00fade. (2020). <\/span>Coronavirus disease (COVID-19) technical guidance: Laboratory testing for 2019-nCoV in humans<\/span><\/a><\/p>\n

    Arya, M., Shergill, I. S., Williamson, M., Gommersall, L., Arya, N., & Patel, H. R.<\/span><\/p>\n

    \"logo_\"<\/a><\/p>\n

    Os argumentos expressos nos posts deste especial s\u00e3o dos pesquisadores, produzidos a partir de seus campos de pesquisa cient\u00edfica e atua\u00e7\u00e3o profissional e foi revisado por pares da mesma \u00e1rea t\u00e9cnica-cient\u00edfica da Unicamp.
    N\u00e3o, necessariamente, representam a vis\u00e3o da Unicamp. Essas opini\u00f5es n\u00e3o substituem conselhos m\u00e9dicos.<\/h4>\n


    editorial<\/a><\/p>\n

    (2005). <\/span>Basic principles of real-time quantitative PCR<\/span><\/a>. Expert review of molecular diagnostics, 5(2), 209-219.<\/span><\/p>\n\t\t\t\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/section>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

    Texto escrito por Maur\u00edlio Bonora Junior e Ana Arnt Em tempos como os atuais, temos visto muitos termos t\u00e9cnicos espec\u00edficos na m\u00eddia e em notas de institui\u00e7\u00f5es que falam tanto da doen\u00e7a COVID-19, quanto do SARs-Cov-2 (o novo Coronav\u00edrus), quanto de sintomas e testes de diagn\u00f3sticos. 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